PCR (έρευνα) - εφαρμογή. Τι είναι η τεχνική PCR;

Η PCR είναι μια δοκιμή που έχει χρησιμοποιηθεί στη διάγνωση πολλών ασθενειών. Η μέθοδος PCR επιτρέπει να δείξει την άμεση παρουσία βακτηρίων στον οργανισμό, και συγκεκριμένα το DNA του. Χρησιμοποιείται PCR, μεταξύ άλλων, στη διάγνωση της νόσου του Lyme. Τι είναι η τεχνική PCR; Τι είναι το PCR σε πραγματικό χρόνο;

Πίνακας περιεχομένων:

1. PCR (δοκιμή) - ποια είναι η τεχνική PCR;
2. PCR (έρευνα) - εφαρμογή της μεθόδου PCR
3. PCR (έρευνα) - Νόσος του Lyme
4. PCR (έρευνα) - αποτελέσματα. Μπορούν να είναι ψευδώς θετικά;
5. PCR (έρευνα) - αποτελέσματα. Μπορούν να είναι ψευδώς αρνητικά

Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι η βασική μέθοδος που χρησιμοποιείται σε γενετικά και μοριακά εργαστήρια. Αναπτύχθηκε το 1983 από την Kara Mullis, η οποία απονεμήθηκε το βραβείο Νόμπελ το 1993 για αυτό.

Ακούστε τι είναι η τεχνική PCR. Αυτό είναι υλικό από τον κύκλο ΑΚΡΟΑΣΗΣ ΚΑΛΗΣ. Podcast με συμβουλές.

Για να δείτε αυτό το βίντεο, ενεργοποιήστε το JavaScript και εξετάστε το ενδεχόμενο αναβάθμισης σε πρόγραμμα περιήγησης ιστού που υποστηρίζει βίντεο

PCR (δοκιμή) - ποια είναι η τεχνική PCR;

Η δοκιμή PCR συνίσταται σε πολλαπλή ενίσχυση (συνήθως 30-40 κύκλους) ενός συγκεκριμένου θραύσματος DNA, π.χ. γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες Borrelia, με τη χρήση του ενζύμου πολυμεράσης.

Στη συνέχεια, χρησιμοποιούνται ειδικές μοριακές βαφές για να γίνει ορατό το ενισχυμένο θραύσμα DNA. Η PCR, λόγω της ενίσχυσης συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA, είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος.

Στη μέθοδο PCR, θραύσματα DNA ενισχύονται χρησιμοποιώντας συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών για μια δεδομένη περιοχή του βακτηριακού DNA. Για παράδειγμα, περιοχές στόχου σε PCR που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση της νόσου Lyme είναι γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, π.χ. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Το βιολογικό υλικό από το οποίο μπορεί να πραγματοποιηθεί η δοκιμή είναι:

• αίμα
• ένα τμήμα του δέρματος από ένα μεταναστευτικό ερύθημα
• εγκεφαλονωτιαίο υγρό
• αρθρικό υγρό ή από αρθρικό χόνδρο
• ούρο

PCR (έρευνα) - εφαρμογή της μεθόδου PCR

Εκτός από τη διάγνωση της Borreliosis Lyme χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PCR, είναι δυνατή η ανίχνευση συγκεκριμένων θραυσμάτων DNA άλλων μικροοργανισμών ή ανθρώπων. Επομένως, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται επίσης σε:

• διάγνωση και παρακολούθηση ιογενών λοιμώξεων: ιοί έρπητα (έρπης, έρπης ζωστήρας, Epstein-Barr, κυτταρομεγαλοϊός), HIV, ιοί ηπατίτιδας (HBV και HCV)
• διάγνωση και παρακολούθηση βακτηριακών λοιμώξεων, ειδικά εκείνων των βακτηρίων που δεν μπορούν να αναγνωριστούν μέσω καλλιεργειών, π.χ. φυματίωσης
• διάγνωση και παρακολούθηση νεοπλασματικών παθήσεων: λευχαιμία, καρκίνος του μαστού, καρκίνος του παχέος εντέρου, καρκίνος του πνεύμονα
• διάγνωση προδιάθεσης για καρκίνο: καρκίνος του μαστού και των ωοθηκών (γονίδια BRCA1 και BRCA2), καρκίνος του παχέος εντέρου (γονίδια APC και CHEK2)
• διαγνωστικά γενετικών ασθενειών: αιμοχρωμάτωση (γονίδιο HFE), θαλασσαιμία (γονίδια HBA1 και HBA2), κοιλιοκάκη (γονίδια HLA)
• εξετάσεις πατρότητας, οι οποίες ανιχνεύουν τη συμβατότητα DNA του παιδιού και του πατέρα

Διαβάστε επίσης: Δοκιμές για τη νόσο του Lyme - πώς μοιάζουν και ποια είναι η τιμή των δοκιμών για τη νόσο του Lyme, το τεστ Western Blot και το Lyme. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των δοκιμών Ασθένειες που προκαλούνται από κρότωνες: ασθένεια Lyme, babesiosis, bartonellosis, TBE και άλλα.

Επί του παρόντος, υπάρχουν πολλές τροποποιήσεις στη μέθοδο PCR. Για παράδειγμα, στη διάγνωση της Lyme borreliosis, χρησιμοποιούνται κυρίως ένθετη PCR και PCR σε πραγματικό χρόνο. Η τελευταία είναι μια ποσοτική μέθοδος και επιτρέπει τον προσδιορισμό του ακριβούς αριθμού αντιγράφων DNA Borrelia στο εξεταζόμενο βιολογικό υλικό.

PCR (έρευνα) και ασθένεια Lyme

Οι ορολογικές εξετάσεις αποτελούν τη βάση για τη διάγνωση της νόσου του Lyme. Ωστόσο, υπάρχουν κλινικές καταστάσεις που μπορεί να προκαλέσουν αυτές τις δοκιμές ψευδείς αρνητικές:

• ορολογικό παράθυρο, δηλ. την αρχική περίοδο μόλυνσης στην οποία ο οργανισμός δεν παράγει ακόμη ειδικά IgM και IgG αντισώματα κατά των Borrelia spirochetes
• σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια που δεν παράγουν αρκετά αντισώματα
• η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων που αποτελούνται από αντιγόνα Borrelia και ειδικά αντισώματα για αυτά, και αποτρέπει την ανίχνευση αντισωμάτων με ορολογικές μεθόδους

Εάν υπάρχουν υποψίες για τα συμπτώματα της νόσου του Lyme στον ασθενή και τα αποτελέσματα των ορολογικών εξετάσεων είναι αρνητικά, μπορούν να πραγματοποιηθούν μοριακές εξετάσεις με βάση τη μέθοδο PCR.

Το DNA των σπειροχαιτών Borrelia μπορεί να ανιχνευθεί στο αρχικό στάδιο της μόλυνσης, επειδή ο αριθμός των σπειροχαιτών στα σωματικά υγρά είναι τότε ο υψηλότερος.

Κατά τη διάγνωση της Borreliosis Lyme, χρησιμοποιούνται κυρίως ορολογικές μέθοδοι όπως η ELISA, αλλά σε ορισμένες κλινικές καταστάσεις οι γενετικές εξετάσεις που χρησιμοποιούν τη μέθοδο PCR είναι χρήσιμες.

Όσο μεγαλύτερος είναι ο χρόνος από τη μόλυνση, τόσο λιγότερο πιθανό είναι να ανιχνευθεί βακτηριακό DNA. Επομένως, σε ορισμένες περιπτώσεις, πριν από τη δοκιμή PCR, τα βακτήρια αναπτύσσονται σε ειδικά μέσα για 1-2 εβδομάδες και στη συνέχεια πραγματοποιείται η δοκιμή.

Αυτή η προσέγγιση χρησιμοποιείται στην περίπτωση υποψίας της νόσου του Lyme και του συλλεγμένου εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Στην τελευταία φάση της λοίμωξης, είναι πιο κατάλληλο να κάνετε μια δοκιμή ELISA.

Η μέθοδος PCR δεν πρέπει να χρησιμοποιείται στη ρουτίνα διάγνωση της Lyme borreliosis λόγω της έλλειψης τυποποίησης σχετικά με την εμφάνιση ποικιλιών Borrelia burgdorferi στην Πολωνία.

Ωστόσο, σε περίπτωση δυσκολιών στη διάγνωση (ειδικά στο αρχικό στάδιο της νόσου), το αποτέλεσμα της εξέτασης PCR βοηθά στη διαγνωστική διαδικασία.

Ένα θετικό αποτέλεσμα της δοκιμής σημαίνει ότι η παρουσία του Borrelia burgdorferi DNA και των ποικιλιών του ανιχνεύθηκε στο υπό δοκιμή υλικό, αλλά δεν εξηγεί εάν μια ενεργή λοίμωξη λαμβάνει χώρα στο σώμα. Από την άλλη πλευρά, ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει την παρουσία βακτηριδίων στο σώμα.

Ορισμένα εργαστήρια προσφέρουν δοκιμές για την παρουσία DNA Borrelia στο τσιμπούρι. Ωστόσο, το αποτέλεσμα μιας τέτοιας εξέτασης δεν αποτελεί τη βάση για τη διάγνωση της νόσου του Lyme σε ένα δαγκωμένο άτομο.

Προτεινόμενο άρθρο:

Δοκιμή ELISA - τι ανιχνεύει; Πώς να διαβάσετε τα αποτελέσματα; Τιμή του τεστ

PCR - αποτελέσματα. Μπορούν να είναι ψευδώς θετικά;

Η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος και, ταυτόχρονα, πολύ ευαίσθητη στη μόλυνση. Επομένως, είναι πολύ σημαντικό στις δοκιμές που βασίζονται σε PCR να επιλέξετε έναν κατάλληλο εσωτερικό έλεγχο για να αποκλείσετε τα ψευδώς θετικά.

Το κλειδί είναι επίσης η σωστή συλλογή υλικού για δοκιμές, καθώς και η εμπειρία και η αξιοπιστία του διαγνώστη που πραγματοποιεί τη δοκιμή.

PCR - αποτελέσματα. Μπορούν να είναι ψευδώς αρνητικά

Όπως σε οποιαδήποτε εργαστηριακή δοκιμή, επίσης στη μέθοδο PCR, ενδέχεται να εμφανιστούν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Εδώ είναι σημαντικό να συλλέξετε αίμα για ένα κατάλληλο αντιπηκτικό, επειδή μερικά από αυτά, όπως η ηπαρίνη, μπορούν να αναστείλουν την αντίδραση PCR.

Επίσης, η συλλογή υλικού μετά την έναρξη της αντιβιοτικής θεραπείας μπορεί να προκαλέσει μείωση της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης PCR και μεγαλύτερη πιθανότητα ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων.

Θα πρέπει επίσης να θυμόμαστε ότι τα βακτήρια Borrelia ζουν για πολύ μικρό χρονικό διάστημα στο αίμα και τα σωματικά υγρά, επειδή χάρη στους ειδικούς υποδοχείς διεισδύουν πολύ γρήγορα σε "δυσπρόσιτα" σημεία του σώματος.

Επομένως, σε αντίθεση με τη διάγνωση άλλων μικροοργανισμών, ο αριθμός των σπειροχαιτών Borrelia σε βιολογικό υλικό είναι μικρός, μερικές φορές ακόμη και στο όριο ανίχνευσης της μεθόδου PCR. Αυτό μπορεί επίσης να προκαλέσει ψευδώς αρνητικό.

Προτεινόμενο άρθρο:

Δοκιμή μετασχηματισμού λεμφοκυττάρων (LTT)

Βιβλιογραφία

1. Dunaj J. et al. Η σημασία της μεθόδου PCR στη διάγνωση της Lyme borreliosis. Ξεφυλλίζω Επιδημιόλη. 2013, 67, 119 - 123.
2. Εργαστηριακή διάγνωση ασθενειών που μεταδίδονται με κρότωνες Συστάσεις της Ομάδας Εργασίας: Εθνικό Επιμελητήριο Διαγνωστικών Εργαστηρίων, Εθνικό Ινστιτούτο Δημόσιας Υγείας-Εθνικό Ινστιτούτο Υγιεινής, Εθνικός Σύμβουλος στον τομέα των μολυσματικών ασθενειών, Τμήμα Λοιμωδών Νοσημάτων και Νευρολογικών Λοιμώξεων, Ιατρικό Πανεπιστήμιο Białystok, Πολωνική Εταιρεία ιολογίας, Βαρσοβία 2014.
3. Ružić-Sabljić E. και Cerar T. Πρόοδος στη μοριακή διάγνωση της νόσου του Lyme. Διάγνωση ειδικών Rev Mol. 2017 Ιαν. 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. et al. Αρχές και εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε ιατρικά διαγνωστικά πεδία: μια ανασκόπηση. Braz J Microbiol. 2009 Ιαν-Μαρ; 40 (1): 1-11.

Σχετικά με τον Συγγραφέα

Karolina Karabin, MD, PhD, μοριακός βιολόγος, διαγνωστικός εργαστηρίου, Cambridge Diagnostics Polska. Βιολόγος με εξειδίκευση στη μικροβιολογία και εργαστηριακός διαγνωστής με εμπειρία άνω των 10 ετών σε εργαστηριακές εργασίες. Απόφοιτος του Κολλεγίου Μοριακής Ιατρικής και μέλος της Πολωνικής Εταιρείας Ανθρώπινης Γενετικής. Επικεφαλής ερευνητικών επιχορηγήσεων στο Εργαστήριο Μοριακών Διαγνωστικών στο Τμήμα Αιματολογίας, Ογκολογίας και Εσωτερικών Νοσημάτων του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Βαρσοβίας. Υπερασπίστηκε τον τίτλο του γιατρού των ιατρικών επιστημών στον τομέα της ιατρικής βιολογίας στην 1η Σχολή Ιατρικής του Ιατρικού Πανεπιστημίου της Βαρσοβίας. Συγγραφέας πολλών επιστημονικών και δημοφιλών επιστημονικών έργων στον τομέα της εργαστηριακής διάγνωσης, της μοριακής βιολογίας και της διατροφής. Σε καθημερινή βάση, ως ειδικός στον τομέα της εργαστηριακής διάγνωσης, διευθύνει το ουσιαστικό τμήμα στο Cambridge Diagnostics Polska και συνεργάζεται με μια ομάδα διαιτολόγων στο CD Dietary Clinic. Μοιράζεται τις πρακτικές του γνώσεις σχετικά με τη διαγνωστική και τη διατροφική θεραπεία ασθενειών με ειδικούς σε συνέδρια, σεμινάρια και σε περιοδικά και ιστότοπους. Ενδιαφέρεται ιδιαίτερα για την επίδραση του σύγχρονου τρόπου ζωής στις μοριακές διαδικασίες στο σώμα.